ROS原癌基因 1 (ROS1) 由位于染色體6q22.1的ROS1基因編碼，屬于酪氨酸激酶胰島素受體亞家族，于1986年在涉及肌肉瘤RNA UR2腫瘤病毒的研究中被發(fā)現(xiàn)。ROS1的生理作用仍存在爭議；其表達(dá)主要在肺組織中觀察到，其次是宮頸和結(jié)腸。可以想象，酪氨酸激酶胰島素受體在胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。ROS1蛋白顯示出與ALK（均屬于胰島素受體超家族）的大量同源性，特別是在ATP結(jié)合位點（84% 同源性）和激酶域（64% 同源性）。ROS1的融合突變，通常會導(dǎo)致與幾個融合伙伴的基因融合，由此產(chǎn)生的融合蛋白是強(qiáng)大的致癌驅(qū)動因素。因此，ROS1激酶活性被持續(xù)激活，由于JAK/STAT、PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、存活和遷移增加。ROS1已在體外和體內(nèi)顯示出致瘤潛力，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是第一個顯示出具有 ROS1重排的人類癌癥。隨后在其他惡性腫瘤中觀察到ROS1融合，包括 NSCLC、黑色素瘤和偶爾的膽管癌、血管肉瘤、卵巢癌、胃癌和結(jié)直腸癌。ROS1改變既不能遺傳也不能作為基因改變獲得。

ROS1的重排約占NSCLC患者的2%，在NSCLC中常見的融合伙伴如下表所示，其中占比最高的是CD74基因。

Table 1. Main ROS1 fusion partners in non-small cell lung cancer (NSCLC).

CD74位于染色體5q33.1，該基因編碼的蛋白質(zhì)與II類主要組織相容性復(fù)合體 (MHC) 相關(guān)，是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)抗原呈遞的重要分子伴侶。它還充當(dāng)細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞遷移抑制因子 (MIF) 的細(xì)胞表面受體，當(dāng)其與編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合時，會啟動存活途徑和細(xì)胞增殖。這種蛋白質(zhì)還與淀粉樣前體蛋白 (APP) 相互作用并抑制淀粉樣蛋白 β (Abeta) 的產(chǎn)生。

在非小細(xì)胞肺癌的診斷中，NCCN指南明確描述“ROS1 is a receptor tyrosine kinase that can be rearranged in NSCLC, resulting in dysregulation and inappropriate signaling through the ROS1 kinase domain."強(qiáng)調(diào)了ROS1的分子診斷的意義，是必須要檢測的一個分子marker，同時推薦的檢測方法描述為“FISH break-apart probe methodology can be deployed; however, it may under-detect the FIG-ROS1 variant. IHC approaches can be deployed; however, IHC for ROS1 fusions has low specificity, and follow-up confirmatory testing is a necessary component of utilizing ROS1 IHC as a screening modality. Numerous NGS methodologies can detect ROS1 fusions, although DNA-based NGS may under-detect ROS1 fusions. Targeted real-time PCR assays are utilized in some settings, although they are unlikely to detect fusions with novel partners."

全套合集之一：藥靶模型

CD74-ROS1融合蛋白，可以組成型激活細(xì)胞增殖，選擇在依賴IL3的BaF3細(xì)胞模型上，外源過表達(dá)CD74-ROS1蛋白，可以作為驅(qū)動基因，驅(qū)動Baf3細(xì)胞的增殖，而不需要IL3，因此可以用于針對CD74-ROS1的抑制劑的活性檢測。基于以上的原理，科佰生物開發(fā)了CD74-ROS1/Baf3藥靶模型，可以在In vitro層面檢測樣本的抑制活性，同樣也可以在in vivo層面做CDX模型，檢測藥物的活性。

Fig 1. Sanger sequencing of CD74-ROS1/BaF3(CBP73331)，左側(cè)為CD74基因，右側(cè)為ROS1基因。

Fig 2. Cell-based kinase assay of CD74-ROS1/BaF3(CBP73331)，不同陽性藥物對CD47-ROS1細(xì)胞增殖抑制的活性比較。

全套合集之二：DNA標(biāo)準(zhǔn)品

我們知道CD74位于5號染色體上，ROS1位于6號染色體上，CD74-ROS1融合是一種易位融合，常見的CD74(E6)-ROS1(E34)在臨床病人的DNA測序上，CD74的斷點是在6號內(nèi)含子上，ROS1的斷點是在33號內(nèi)含子上，而且不同的病例，斷點不止一個，因此基于CD74-ROS1在DNA層面的標(biāo)準(zhǔn)品，首先肯定斷點在內(nèi)含子上，其次一種標(biāo)準(zhǔn)品僅代表一種斷點。基于以上信息，科佰生物通過基因編輯技術(shù)開發(fā)定制了一款DNA層面的CD74(E6)-ROS1(E34)，通過sanger測序、ddPCR檢測對DNA做定標(biāo)，發(fā)布一款DNA標(biāo)準(zhǔn)品。

Fig 3. Sanger sequencing of CD74-ROS1 Translocation(CBP20177D)，左側(cè)為CD74基因，右側(cè)為ROS1基因，斷點為內(nèi)含子斷點。

Fig 4.ddPCR of CD74-ROS1 Translocation(CBP20177D)，檢測顯示該標(biāo)準(zhǔn)品突變頻率為50%。

全套合集之三：RNA標(biāo)準(zhǔn)品

CD74-ROS1融合在病理上有意義，主要是因為融合蛋白的活性，也就是說，假設(shè)DNA層面出現(xiàn)融合，但是沒有RNA，進(jìn)而沒有蛋白，其實也沒有任何意義的，因此針對CD74-ROS1的RNA的檢測，會更有意義。科佰生物通過基因重組的技術(shù)，在RNA層面定制出CD74(E6)-ROS1(E34)的細(xì)胞模型，再通過sanger測序，ddPCR檢測對RNA做定標(biāo)，發(fā)布一款RNA標(biāo)準(zhǔn)品。

Fig 5. Sanger sequencing of CD74-ROS1 Fusion(CBP20170R)，左側(cè)為CD74基因，右側(cè)為ROS1基因，斷點為外顯子斷點。

Fig 6. DdPCR of CD74-ROS1 Fusion(CBP20170R)，檢測顯示該標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為2244.5copies/ng。

全套合集之四：ddPCR試劑盒

不管是針對CD74-ROS1融合的藥物研發(fā)，還是診斷，在各種應(yīng)用檢測中，都少不了PCR的檢測技術(shù)，比如在藥靶模型的構(gòu)建中，我們可以使用PCR的技術(shù)看外源基因是否過表達(dá)，看陽性比例，篩選克隆，方法學(xué)優(yōu)化等等，比如在診斷中，可以篩選陽性病人，性能評價，平時的質(zhì)控等等。在PCR技術(shù)中，ddPCR是一種靈敏度高的絕對定量的一種方法，比起Q-PCR，靈敏度高，不需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，比起NGS，成本低，周期短，能快遞出結(jié)果。科佰生物開發(fā)了針對DNA和RNA的ddPCR檢測試劑盒，適用于在藥物研發(fā)和臨床診斷中的檢測。

Fig 7. 針對CD74-ROS1的DNA層面ddPCR性能評價，使用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到不同的%AF，在不同的%AF下顯示準(zhǔn)確的檢測能力。

Fig 8. 針對CD74-ROS1的RNA層面ddPCR性能評價，使用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到不同的拷貝數(shù)，在不同的拷貝數(shù)下顯示準(zhǔn)確的檢測能力（注意RNA需要反轉(zhuǎn)錄為cDNA檢測，反轉(zhuǎn)錄需要在*相同的體系下開展）。